Что такое прямая иммунофлуоресценция?
Прямая иммунофлуоресценция (ПИФ, РИФ) — это лабораторный метод исследования, используемый для диагностики заболеваний кожи, почек и других органов. Данный тест также называют прямой иммунофлуоресцентной реакцией или первичной иммунофлуоресценцией.
Метод ПИФ заключается в нанесении молекул конъюгатов специфических антител с флуорофорами на срезы биоптата ткани пациента. Эти конъюгаты связываются с патологическими скоплениями белков (иммуноглобулинов, компонентов комплемента) в тканях. При воздействии света определенной длины волны флуорофор испускает собственное свечение, которое визуализируется с помощью люминесцентного микроскопа. Характерный тип свечения (паттерн) и локализация патологических белковых депозитов в биоптате позволяют точно верифицировать заболевание.
Прямая иммунофлуоресценция в диагностике дерматозов
ПИФ незаменима при подозрении на аутоиммунные заболевания, диффузные болезни соединительной ткани и васкулиты. Характер распределения свечения в тканях может быть строго нозологически специфичным либо требует интерпретации в совокупности с клинической картиной и данными световой микроскопии (окраска гематоксилином и эозином).
Аутоиммунные буллезные дерматозы
ПИФ информативна при диагностике следующих аутоиммунных пузырных заболеваний:
- Вульгарная пузырчатка (pemphigus vulgaris)
- Листовидная пузырчатка (pemphigus foliaceus)
- Паранеопластическая пузырчатка
- IgA-зависимая пузырчатка
- Буллезный пемфигоид Левера
- Пемфигоид беременных (герпес беременных)
- Пемфигоид слизистых оболочек (рубцующийся пемфигоид)
- Приобретенный буллезный эпидермолиз
- Буллезная системная красная волчанка (СКВ)
- Линейный IgA-зависимый буллезный дерматоз
- Герпетиформный дерматит Дюринга.
Болезни соединительной ткани
ПИФ применяется для верификации следующих заболеваний соединительной ткани:
- Красная волчанка (системная, дискоидная и подострая кожная формы)
- Неонатальная красная волчанка
- Системная склеродермия (системный склероз)
- Смешанное заболевание соединительной ткани (синдром Шарпа)
- Дерматомиозит.
Васкулиты и другие патологические состояния
ПИФ используется в дифференциальной диагностике кожных ангиитов (васкулитов) и ряда других воспалительных дерматозов:
- Васкулит мелких сосудов кожи (лейкоцитокластический / аллергический васкулит)
- Пурпура Шенлейна — Геноха (геморрагический васкулит, IgA-васкулит)
- Красный плоский лишай
- Поздняя кожная порфирия
- Некоторые токсикодермии (лекарственные экзантемы)
- Сыпи при фотосенсибилизации
Выбор места биопсии
Оптимальная локализация для забора биоптата кожи определяется предполагаемым диагнозом:
- Аутоиммунные буллезные дерматозы: биопсию берут из внешне неизмененной перифокальной зоны на расстоянии менее 1 см от края свежей буллы. Поскольку забор ткани с нижних конечностей часто дает ложноотрицательные результаты, этой анатомической зоны следует по возможности избегать.
- Болезни соединительной ткани: биоптат иссекают из сформировавшегося очага поражения (преимущественно на открытых солнцу участках), существующего более 6 месяцев, но сохраняющего признаки активности. Нередко дополнительно берется биоптат из интактной кожи, защищенной от инсоляции (волчаночный тест полоски / Lupus band test).
- Васкулиты: наилучшие результаты дает панч-биопсия или глубокая тангенциальная (shave) биопсия свежего элемента (пурпуры) давностью менее 24 часов.
Второй образец ткани всегда забирается для стандартного патоморфологического исследования (окраска гематоксилином и эозином). Правила забора для него имеют свои отличия:
- Аутоиммунные буллезные дерматозы: иссекается везикула целиком либо край буллы с подлежащей дермой.
- Васкулиты: выбирается пальпируемая пурпура давностью не более 72 часов.
Транспортировка и хранение биопсийного материала
Материал, предназначенный для ПИФ, категорически запрещено помещать в формалин, так как он вызывает денатурацию белков и полностью нивелирует информативность исследования. Доставить образец в лабораторию необходимо как можно быстрее. Допустимые варианты транспортировки:
- На марлевой салфетке, смоченной стерильным изотоническим раствором натрия хлорида
- В пробирке с физиологическим раствором
- В специальных транспортных средах (например, среде Мишеля или Зевса)
- В замороженном виде в жидком азоте (размораживание образца недопустимо).
Лабораторные протоколы могут различаться. Образцы, доставленные в физрастворе, могут демонстрировать даже более высокую чувствительность по сравнению с синтетическими средами, если криосрезы изготавливаются в течение первых 24–48 часов.
Этапы лабораторной обработки образца
ПИФ может проводиться в автоматизированном или ручном режиме. Процесс включает приготовление замороженных криосрезов с последующей постановкой иммунофлуоресцентной реакции.
Приготовление криосрезов
- Панч-биоптат доставляется в лабораторию на увлажненной физраствором марле.
- Образец помещается в криогель (транспортно-заливочную среду).
- Гель с образцом подвергается криофиксации в парах или жидком азоте.
- Биоптат оказывается надежно зафиксирован внутри замороженного блока геля.
- В жидком азоте замороженный блок может храниться приблизительно одну неделю.
- На микротоме-криостате изготавливаются ультратонкие срезы толщиной 4–6 мкм.
Панч-биоптат на марле, смоченной физраствором
Образец в криогеле
Хранение в жидком азоте
Замороженный образец
Образец в контейнере с жидким азотом
Микротомия замороженных срезов кожи
Проведение реакции прямой иммунофлуоресценции
- Готовится серия из пяти-шести предметных стекол со срезами под различные реагенты. Один срез окрашивается гематоксилином и эозином для контроля морфологии.
- Гидрофобным маркером очерчиваются зоны срезов для удержания растворов антител.
- Стекла промываются в буферном растворе.
- Готовятся растворы антител, конъюгированных с флуорохромами.
- На предметные стекла наносятся флуоресцентные конъюгаты к IgG, IgM, IgA, C3-компоненту комплемента и, при необходимости, к фибриногену; затем препараты инкубируются в темноте.
- Стекла повторно отмываются в буфере от несвязавшихся антител.
- Препараты заключаются под покровные стекла в полимеризующуюся среду.
Серия предметных стекол
Разметка гидрофобным маркером
Отмывка стекол в буферном растворе
Приготовление флуоресцентных реагентов
Конъюгаты антител
Нанесение реагентов на срезы
Повторная отмывка
Подготовка к заключению под покровное стекло
Заключение срезов
Интерпретация результатов ПИФ
Препараты оцениваются врачом-патоморфологом с помощью люминесцентного микроскопа для определения топографии отложений (если они имеются), классов иммуноглобулинов или факторов комплемента, а также характера их свечения. Выделяют пять основных типов (паттернов) свечения:
- Межклеточное свечение шиповатого слоя (межклеточный паттерн)
- Линейное свечение зоны базальной мембраны (ЗБМ)
- Гранулярное свечение зоны базальной мембраны (ЗБМ)
- «Лохматое» (бахромчатое / shaggy) свечение зоны базальной мембраны
- Сосудистое свечение и другие специфические типы отложений.
Вульгарная пузырчатка
Листовидная пузырчатка
Буллезный пемфигоид
Депозиты C3 в зоне базальной мембраны
Периваскулярное свечение
Линейный IgA-зависимый буллезный дерматоз
Примеры диагностических паттернов
- Межклеточное свечение («рыболовная сеть» / «сетка-рабица»): вульгарная пузырчатка.
- Субкорнеальное межклеточное свечение: листовидная пузырчатка.
- Линейное отложение IgG вдоль зоны базальной мембраны: буллезный пемфигоид.
- Линейное отложение IgA вдоль зоны базальной мембраны: линейный IgA-дерматоз.
- Сосудистое свечение (депозиты IgM в стенках сосудов дермы): лейкоцитокластический васкулит.
- Гранулярное отложение C3 вдоль зоны базальной мембраны.
Паттерны свечения при конкретных нозологиях
Вульгарная пузырчатка
- Межклеточное свечение IgG (90–100%) и/или C3 в эпидермисе.
Листовидная пузырчатка
- Межклеточное свечение IgG и/или C3 преимущественно в верхних слоях шиповатого пласта.
Паранеопластическая пузырчатка
- Слабовыраженное межклеточное свечение IgG.
- Линейные или гранулярные депозиты IgG или C3 в зоне базальной мембраны.
- Иногда выявляются изменения по лихеноидному типу.
IgA-пузырчатка
- Межклеточное свечение с фиксацией IgA.
Буллезный пемфигоид
- Непрерывное линейное свечение вдоль ЗБМ с отложением IgG и компонента комплемента C3.
Пемфигоид слизистых оболочек (рубцующийся пемфигоид)
- Линейное свечение вдоль ЗБМ с депозитами IgG, C3 и IgA.
Приобретенный буллезный эпидермолиз
- Линейные депозиты IgG и C3 вдоль ЗБМ.
- В редких случаях — линейная фиксация IgA или IgM.
Герпетиформный дерматит Дюринга
- Гранулярное свечение в верхушках дермальных сосочков с отложением IgA.
- Иногда — гранулярные депозиты C3.
- Крайне редко — сочетанные гранулярные депозиты IgG и IgM.
Красная волчанка
- Системная красная волчанка:
- Гранулярные депозиты IgG, IgM, IgA, C3 вдоль ЗБМ («волчаночная полоса»).
- Крапчатое/гранулярное свечение ядер кератиноцитов IgG (10–15%).
- Дискоидная красная волчанка:
- Гранулярные депозиты IgG, IgM вдоль ЗБМ.
- Цитоидные тельца (тельца Сиватта) в дерме, содержащие IgM и IgA.
- Подострая кожная красная волчанка:
- Гранулярная фиксация IgG, IgM, C3 вдоль ЗБМ.
- Внутрицитоплазматические пылевидные включения IgG в базальных кератиноцитах.
- Цитоидные тельца, содержащие IgM, IgA.
Системный склероз (склеродермия)
- Гранулярные депозиты IgM вдоль ЗБМ.
- Крапчатое окрашивание ядер эпидермоцитов (в 20% случаев).
Смешанное заболевание соединительной ткани
- Гранулярное свечение ЗБМ (15%).
- Крапчатый ядерный паттерн IgG эпидермоцитов (46–100%).
Дерматомиозит
- Гранулярные отложения IgM, IgG, C3 вдоль зоны базальной мембраны.
- Цитоидные тельца с фиксацией IgM, IgA.
Лихеноидные реакции (красный плоский лишай, токсикодермии, фотодерматозы)
- Бахромчатый («лохматый») паттерн вдоль ЗБМ для фибриногена.
- Многочисленные коллоидные тельца (тельца Сиватта) в дерме, окрашивающиеся на IgM и IgA.
Поздняя кожная порфирия
- Сосуды дермы: выраженное непрерывное муфтообразное свечение стенок с IgG, IgA, C3.
- Гранулярные депозиты C3, IgM вдоль ЗБМ.
- Линейное отложение IgG, IgA вдоль ЗБМ.
Васкулиты
- Интенсивное периваскулярное и интрамуральное свечение сосудов дермы с IgM, IgG, C3, фибриногеном.
Пурпура Шенлейна — Геноха (IgA-васкулит)
- Преимущественное массивное отложение IgA в стенках сосудов поверхностного сплетения дермы.
Надежность и точность результатов ПИФ
ПИФ обладает высокой чувствительностью при широком спектре дерматозов. Чувствительность метода приближается к 100% при истинной акантолитической пузырчатке и составляет от 55% до 96% при буллезном пемфигоиде. В исследованиях с участием пациентов с пурпурой Шенлейна — Геноха и красной волчанкой положительные результаты ПИФ наблюдались у 100% больных.
Вероятность получения ложноотрицательного результата напрямую зависит от соблюдения техники биопсии, условий транспортировки и того, получает ли пациент иммуносупрессивную терапию. Основные причины ложноотрицательных результатов:
- Неправильно выбранное место для биопсии.
- Отсутствие эпидермиса в срезе или иные технические дефекты забора ткани.
- Длительное нахождение биоптата в неспециализированной среде до доставки в лабораторию.
- Фотовыцветание (выгорание) флуорохромов и ошибки при микроскопии.
- Проведение биопсии на фоне активной системной или топической иммуносупрессивной / противовоспалительной терапии.