Что такое непрямая иммунофлуоресценция?

Непрямая иммунофлуоресценция (НРИФ), или вторичная иммунофлуоресценция — это лабораторный метод, применяемый для обнаружения циркулирующих аутоантител в сыворотке крови пациента. Он используется для диагностики аутоиммунных буллезных (пузырных) дерматозов.

  • Немеченые первичные антитела из сыворотки крови пациента связываются с целевыми молекулами (антигенами) в предварительно подготовленных срезах тканей-субстратов.
  • Вторичные антитела, конъюгированные с флуоресцентным красителем (флуорохромом, например, флуоресцеина изотиоцианатом — ФИТЦ/FITC), связываются с первичными антителами пациента.
  • Под воздействием света определенной длины волны флуорохром возбуждается и испускает свечение, которое визуализируется с помощью люминесцентного (флуоресцентного) микроскопа.

Используемые тканевые субстраты (например, пищевод обезьяны или расщепленная кожа человека) подбираются в зависимости от предполагаемого диагноза. Различные типы свечения помогают верифицировать конкретное аутоиммунное буллезное заболевание.

При каких буллезных дерматозах применяется НРИФ?

Метод непрямой иммунофлуоресценции используется для диагностики следующих аутоиммунных пузырных заболеваний:

Лабораторная методика

Подготовка сыворотки пациента к исследованию

  1. Производится забор 5–10 мл венозной крови в пробирку без антикоагулянта.
  2. Крови дают свернуться для формирования сгустка.
  3. Образец центрифугируют для отделения сыворотки от форменных элементов и фибринового сгустка.
  4. Сыворотку разделяют на аликвоты и замораживают до проведения анализа.

Проведение реакции непрямой иммунофлуоресценции

  1. Ткань-субстрат нарезается на срезы толщиной 4–6 микрон для микроскопии (это может выполняться в лаборатории либо используются коммерческие тест-системы).
  2. Готовится серия стекол с различными тканевыми субстратами.
  3. Срезы тканей инкубируют с сывороткой пациента в течение 30 минут; при необходимости определения титра антител проводят серию двукратных разведений сыворотки.
  4. Препараты отмывают буферным раствором для удаления несвязавшихся первичных антител.
  5. Срезы повторно инкубируют в течение 30 минут со вторичными антителами, меченными флуоресцентным красителем.
  6. Препарат заключают под покровное стекло в специальную монтирующую среду.
  7. Каждый образец исследуют в люминесцентном микроскопе.

Интерпретация результатов непрямой иммунофлуоресценции

Микропрепараты исследуются для определения циркулирующих аутоантител по характерным паттернам иммунного свечения. Оценка результатов носит субъективный характер, в связи с чем НРИФ не всегда может служить надежным критерием для строгого мониторинга активности патологического процесса и ответа на терапию.

К основным типам иммунофлуоресцентного свечения при НРИФ относятся:

  • Межклеточное свечение шиповатого слоя эпидермиса (межклеточная флуоресценция, ICS-паттерн);
  • Линейное или гранулярное свечение зоны базальной мембраны (BMZ-паттерн).

Чувствительность диагностического метода отражает его способность выявлять лиц с подтвержденным заболеванием (истинно положительный результат). Специфичность метода — способность верно идентифицировать лиц, не страдающих данным заболеванием (истинно отрицательный результат).

В редких случаях тест может давать ошибочные результаты:

  • Результат может быть отрицательным при наличии болезни (ложноотрицательный результат).
  • Результат может оказаться положительным у пациента без клинических проявлений заболевания (ложноположительный результат).

Паттерны флуоресценции при различных дерматозах

Ниже описаны характерные картины иммунофлуоресценции при основных пузырных заболеваниях кожи.

Вульгарная пузырчатка

При вульгарной пузырчатке НРИФ демонстрирует:

  • Межклеточное свечение в шиповатом слое (ICS-паттерн) с фиксацией депозитов IgG или C3-компонента комплемента;
  • Чувствительность: 81–87% [4,7];
  • Специфичность: 81% [7].

Вульгарная пузырчатка (Pemphigus vulgaris)

Листовидная пузырчатка

При листовидной пузырчатке НРИФ демонстрирует:

  • Межклеточный тип свечения эпидермиса (IgG или C3), преимущественно в верхних слоях;
  • Чувствительность: 60–86% [4,7].

Листовидная пузырчатка (Pemphigus foliaceus)

Паранеопластическая пузырчатка

При паранеопластической пузырчатке выявляются:

  • Специфические циркулирующие антитела классов IgG и фиксация C3-компонента комплемента (часто как межклеточное свечение, так и флуоресценция зоны базальной мембраны);
  • Чувствительность: 80% [3];
  • Специфичность: 83% [3].

Буллезный пемфигоид

При буллезном пемфигоиде определяются:

  • Линейное свечение зоны базальной мембраны (BMZ) за счет фиксации IgG и C3;
  • Чувствительность: 70% [3].

Буллезный пемфигоид (Bullous pemphigoid)

Пемфигоид слизистых оболочек

При пемфигоиде слизистых оболочек визуализируются:

  • Свечение зоны базальной мембраны (BMZ) с отложением антител классов IgG или IgA;
  • Чувствительность: около 20% [3].

Пемфигоид беременных

При пемфигоиде беременных наблюдаются:

  • Депозиты C3-компонента комплемента вдоль зоны базальной мембраны;
  • Чувствительность: 93% [3].

Приобретенный буллезный эпидермолиз

При приобретенном буллезном эпидермолизе НРИФ выявляет:

  • Линейное свечение зоны базальной мембраны с антителами класса IgG (при использовании расщепленной кожи — свечение дермальной стороны расщепа);
  • Чувствительность: 50% [3].

Приобретенный буллезный эпидермолиз (Epidermolysis bullosa acquisita)

Герпетиформный дерматит

При герпетиформном дерматите Дюринга НРИФ позволяет выявить:

  • IgA-антиэндомизиальные антитела (EMA);
  • Чувствительность: 80% [3].

Линейный IgA-зависимый буллезный дерматоз и хронический буллезный дерматоз детского возраста

При этих нозологиях выявляются:

  • Линейные депозиты антител класса IgA вдоль зоны базальной мембраны;
  • Чувствительность: 50% [3].

Буллезная красная волчанка

При буллезной системной красной волчанке визуализируется линейный паттерн свечения зоны базальной мембраны с отложением IgG-аутоантител.

Список литературы

  1. Chhabra S, Minz RW, Saikia B. Immunofluorescence in dermatology. Indian J Dermatol Venereol Leprol 2012; 78; 677–92. DOI: 10.4103/0378-6323.102355. Journal
  2. Fitzpatrick RE, Newcomer VD. The correlation of disease activity and antibody titers in pemphigus. Arch Dermatol 1980; 116; 285–90. DOI: 10.1001/archderm.1980.01640270045011. PubMed
  3. Fleming Dermatopathology. Immunodermatology guidelines. 2010. Available at: http://flemingdp.com/index.php/services/immunodermatology/guidelines (accessed December 2017)
  4. Jiao D, Bystryn JC. Sensitivity of indirect immunofluorescence, substrate specificity, and immunoblotting in the diagnosis of pemphigus. J Am Acad Dermatol 1997; 37; 211–16. PubMed
  5. Mascaro Jr JM. Histological and immunofluorescence diagnosis of autoimmune blistering diseases. In: Murrell DF (eds). Blistering diseases. New York: Springer-Verlag, 2015: 161–92.
  6. Mayo Medical Laboratories. Cutaneous immunofluorescence testing. Reviewed August 2014. Available at: http://www.mayomedicallaboratories.com/it-mmfiles/Cutaneous_Immunofluorescence_Testing.pdf (accessed 26 May 2017)
  7. Zagorodniuk I, Weltfriend S, Shtruminger L, et al. A comparison of anti-desmoglein antibodies and indirect immunofluorescence in the serodiagnosis of pemphigus vulgaris. Int J Dermatol, 2005; 44; 541–4. DOI: 10.1111/j.1365-4632.2004.02541.x. PubMed

Связанные темы на DermNet