Что такое отражательная конфокальная микроскопия?

В дерматологии отражательная (рефлексивная) конфокальная микроскопия (ОКМ, RCM) — это неинвазивный метод визуализации, позволяющий исследовать слои кожи in vivo от эпидермиса до сосочкового слоя дермы в режиме реального времени. Разрешающая способность методики сопоставима со стандартным гистологическим исследованием. Ее ключевое преимущество заключается в возможности выполнения так называемой «виртуальной биопсии» кожи, что помогает клиницисту выявить диагностические критерии и свести к минимуму число необоснованных инвазивных биопсий кожи.

Конфокальный микроскоп был изобретен профессором Марвином Мински в середине 1950-х годов. Применение ОКМ для визуализации структур кожи впервые описали доктор Раджадьяaksha и соавторы в 1995 году. С тех пор метод вызывает огромный интерес для диагностики злокачественных новообразований кожи, в частности меланомы, а также воспалительных дерматозов.

Как работает отражательная конфокальная микроскопия?

В качестве источника монохроматического и когерентного излучения в ОКМ используется диодный лазер.

  • Лазерный луч проходит через светоделитель, систему сканирующих и фокусирующих линз и контактное устройство, прилегающее к коже.
  • Излучение проникает в кожу и освещает точечный микроучасток ткани.
  • Свет, отраженный от фокальной точки, возвращается через объектив, который фокусирует его на точечной диафрагме (pinhole), формируя изображение на фотодетекторе.
  • Отверстие диафрагмы пропускает только тот свет, который исходит строго из фокальной точки (то есть является конфокальным), и отсекает рассеянные лучи, идущие от соседних участков ткани или плоскостей, находящихся вне фокуса.

Принцип ОКМ основан на отражении (обратном рассеянии) света от структур с естественным эндогенным контрастом, таких как меланин, гемоглобин и некоторые клеточные органеллы. Отражение происходит на границе раздела сред с разными показателями преломления — например, на клеточных мембранах, кератогиалиновых гранулах и меланосомах.

В распространенной коммерческой системе Vivascope® 1500 применяется лазер с длиной волны 830 нм, поскольку данное излучение безопасно для тканей пациента и сетчатки глаз оператора. Глубина проникновения составляет 200–300 мкм, что обычно соответствует уровню сосочкового или верхней части сетчатого слоя дермы.

Конфокальный микроскоп 

Конфокальный микроскоп 

Как проводится процедура конфокальной микроскопии?

ОКМ — абсолютно безболезненное исследование.

  • На исследуемый участок кожи наносят каплю иммерсионного масла (показатель преломления масла близок к показателю преломления рогового слоя).
  • К металлическому кольцу фиксируют покровное стекло и устанавливают кольцо на каплю масла.
  • Стеклянное окно крепят к коже специальным медицинским адгезивным кольцом-пластырем для предотвращения смещения во время сканирования.
  • Внутрь кольца наносят водную иммерсионную среду (воду или водорастворимый гель), после чего кольцо магнитно стыкуется с тубусом объектива микроскопа.

ОКМ позволяет выполнять горизонтальное оптическое сканирование ткани на выбранной глубине.

  • Размер одного базового кадра составляет 5 × 5 мм. Суммарно можно сканировать новообразования размером до 8 × 8 мм.
  • Базовые кадры объединяются программным обеспечением в единый панорамный блок (мозаику).
  • Серия последовательных вертикальных срезов, полученных в одной и той же точке по горизонтали на разной глубине, называется стеком (stack).
  • Трехмерный «куб» представляет собой стек из нескольких объединенных мозаичных блоков.

Аппарат ОКМ оснащен насадкой для дерматоскопа, что обеспечивает точную корреляцию дерматоскопических данных с конфокальной картиной. Кроме того, возможно проведение видеозаписи капиллярного кровотока в реальном времени.

Клиническое применение отражательной конфокальной микроскопии

ОКМ применяется для дифференциальной диагностики доброкачественных и злокачественных новообразований кожи, таких как:

ОКМ используется для мониторинга проводимой терапии:

  • Оценка эффективности топического имиквимода при лечении актинического кератоза;
  • Интраоперационная оценка краев резекции ex vivo при проведении микрографической хирургии по Мосу (Mohs).

Согласно международному консенсусу (январь 2017 г.), оптимальными показаниями к назначению ОКМ признаны:

  • Новообразования в области головы и шеи на фоне хронического фотоповреждения кожи;
  • Очаги с дерматоскопическими признаками регресса;
  • Беспигментные (амеланотические) опухоли.

Кроме того, метод эффективен в диагностике воспалительных заболеваний и паразитарных инвазий кожи:

Картина нормальной кожи при отражательной конфокальной микроскопии

Роговой слой (stratum corneum)

  • Роговой слой выглядит как высокорефрактерная (ярко-белая) поверхность, иссеченная темными бороздками (кожными складками).
  • Корнеоциты представляют собой крупные (10–30 мкм) полигональные безъядерные клетки.

Зернистый слой (stratum granulosum)

  • Кератиноциты зернистого слоя имеют четко очерченные границы и формируют сотовидный рисунок (honeycomb pattern).
  • Цитоплазма выглядит зернистой и яркой за счет органелл и гранул кератогиалина.

Шиповатый слой (stratum spinosum)

  • Кератиноциты шиповатого слоя меньшего размера (15–25 мкм), полигональные, имеют узкий ободок светлой цитоплазмы и темные овальные ядра.
  • Они также формируют упорядоченный сотовидный рисунок.

Базальный слой (stratum basale)

  • Базальные кератиноциты мелкие (7–12 мкм), мономорфные, визуализируются как яркие клетки за счет меланиновых «шапочек» над ядрами.
  • Меланоциты и пигментированные кератиноциты выглядят как одиночные округлые/овальные светлые структуры, оптически трудно различимые между собой.
  • У лиц со II–IV фототипами кожи по Фитцпатрику базальные клетки образуют скопления гиперрефрактерных элементов, формируя в верхних срезах рисунок по типу «булыжной мостовой» (cobblestone pattern).

Дермо-эпидермальное сочленение (ДЭС)

  • В области ДЭС мелкие базальные кератиноциты и меланоциты формируют яркие кольца вокруг темных дермальных сосочков.
  • Внутри сосочков различимы сосудистые петли капилляров с движущимися форменными элементами крови.
  • Такая упорядоченная структура называется «окаймленным сосочком» (edged papilla).

Дерма

  • Кровеносные сосуды дермы визуализируются в виде темных трубчатых структур, внутри которых различимы слабо- и гиперрефрактерные клетки крови.
  • Коллагеновые волокна выглядят как яркие удлиненные фибриллярные тяжи.

Конфокальные признаки новообразований кожи

Меланома

Ранняя меланома характеризуется следующими признаками:

  • Дезорганизация и сглаженность дермо-эпидермального сочленения;
  • Нечеткие контуры сосочков («неокаймленные сосочки» / non-edged papillae);
  • Чередование дермальных сосочков с пролиферацией одиночных клеток и гнезд атипичных меланоцитов с утратой регулярного рисунка (неспецифический паттерн);
  • Замещение дермальных сосочков скоплениями атипичных клеток.

Признаки инвазивной и распространенной меланомы:

  • Злокачественные клетки замещают всю зону сочленения;
  • Крупные гиперрефрактерные полиморфные клетки, свободно лежащие в эпидермисе;
  • Крупные яркие клетки с эксцентричными темными ядрами в поверхностных слоях эпидермиса (педжетоидная диссеминация);
  • Церебриформные (мозговидные) гнезда при узловой форме меланомы.

Меланоцитарные невусы

  • В большинстве случаев визуализируется сетчатый (meshwork) рисунок, соответствующий пограничному компоненту.
  • Пограничные гнезда представляют собой четко очерченные округлые скопления клеток, местами связанные с эпидермисом.
  • При сложных невусах определяется глыбчатый (clod) паттерн, соответствующий гнездам меланоцитов в сосочковом слое дермы.

Доброкачественный кератоз

  • Термин «доброкачественный кератоз» объединяет солнечное лентиго, себорейный кератоз, лихеноидный кератоз (lichen planus-like keratosis) или их комбинацию.
  • На уровне дермо-эпидермального сочленения отмечается увеличение плотности дермальных сосочков, окруженных мономорфным слоем ярких клеток.

Гистологическая картина доброкачественного кератоза 

Дерматоскопия доброкачественного кератоза 

Рисунок 1. Дермо-эпидермальное сочленение 

Рисунок 2. Супрабазальные слои эпидермиса 

Изображения предоставлены: Dr Manu Jain.

Рисунок 1. ОКМ-изображение доброкачественного кератоза на уровне дермо-эпидермального сочленения: определяются округлые и полиморфные окаймленные сосочки, окруженные ободком ярких мономорфных клеток (наконечник стрелки), и роговая псевдокиста (стрелка).

Рисунок 2. ОКМ-изображение доброкачественного кератоза в супрабазальном слое эпидермиса: визуализируется паттерн по типу «булыжной мостовой» — плотно прилежащие округлые клетки одинакового размера и рефрактерности с ровными межклеточными промежутками, разграниченные менее рефрактерным полигональным контуром.

Базальноклеточный рак

Признаки базальноклеточного рака (БКР):

  • Компактные островки опухолевых клеток с характерным периферическим палисадообразным расположением ядер;
  • Темная щель по периферии опухолевых комплексов (эффект ретракции стромы);
  • Выраженная сеть эктазированных извитых капилляров вокруг опухолевых гнезд.

Плоскоклеточный рак

Признаки плоскоклеточного рака (ПКР):

  • Выраженная вариабельная атипия кератиноцитов;
  • Атипичный сотовидный рисунок и архитектоническая дезорганизация в шиповатом и зернистом слоях;
  • Расширенные капиллярные петли в дермальных сосочках, ориентированные перпендикулярно поверхности кожи;
  • Яркие гиперкератотические чешуйко-корки на поверхности эпидермиса.

Конфокальная картина воспалительных дерматозов

Воспалительные заболевания кожи при ОКМ можно разделить на 4 основные группы:

  • Спонгиотические дерматиты;
  • Псориазиформные дерматозы;
  • Дерматозы с изменениями зоны сочленения (интерфейс-дерматиты);
  • Неопухолевые нарушения пигментации.

Псориаз

Признаки вульгарного бляшечного псориаза:

  • Неокаймленные сосочки на уровне дермо-эпидермального сочленения: сосочки окружены бледными кольцами базальных кератиноцитов вместо характерных ярких колец;
  • Выраженное утолщение эпидермиса (акантоз);
  • Множественные извитые, эктазированные капилляры внутри бескаемных сосочков.

Спонгиотический дерматит

Спонгиотический дерматит характеризуется следующими критериями:

  • Межклеточный отек (спонгиоз) с формированием расширенных межклеточных пространств;
  • Спонгиотические микровезикулы, визуализируемые как округлые темные полости в шиповатом и зернистом слоях;
  • Экзоцитоз: скопления мелких округлых ярких клеток (воспалительных инфильтратов), рассеянных между кератиноцитами, вокруг сосудов, придатков кожи и в дерме.

Ограничения метода ОКМ

В современных конфокальных микроскопах глубина визуализации ограничена 200–300 мкм, что соответствует сосочковому слою дермы. В связи с этим патологические очаги или воспалительные инфильтраты, залегающие глубже, недоступны для оценки.

К другим ограничениям относятся:

  • Трудность надежной дифференциации доброкачественных спицоидных новообразований от меланомы в большинстве клинических случаев;
  • Выраженный гиперкератоз и массивные корки, затрудняющие прохождение луча и визуализацию дермо-эпидермального сочленения;
  • Необходимость длительного специализированного обучения специалиста для интерпретации конфокальных томограмм;
  • Относительная громоздкость зонда сканера, что затрудняет осмотр труднодоступных анатомических зон с вогнутым рельефом (ушная раковина, внутренний угол глаза).

Литература

  • Calzavara‐Pinton P, Longo C, Venturini M, Sala R, Pellacani G. Reflectance confocal microscopy for in vivo skin imaging. Photochem Photobiol. 2008;84(6):1421–30. PubMed
  • Longo C, Zalaudek I, Argenziano G, Pellacani G. New directions in dermatopathology In vivo confocal microscopy in clinical practice. Dermatol Clin. 2012 Oct; 30: 799–814. PubMed
  • Hofmann-Wellenhof R, Pellacani G, Malvehy J, Soyer HP, editors. Reflectance confocal microscopy for skin diseases. Heidelberg: Springer; 2012.
  • Associate Professor Pascale Guitera FACD PhD, Menzies, S, Dr Alex Chamberlain, Soyer, P, Cancer Council Australia Melanoma Guidelines Working Party. [Version URL: http://wiki.cancer.org.au/australiawiki/index.php?oldid=151860, cited 2017 Jan 25]. In: Cancer Council Australia Melanoma Guidelines Working Party. Clinical practice guidelines for the Diagnosis and Management of Melanoma. Sydney: Cancer Council Australia.
  • Levine A, Markowitz O. Introduction to reflectance confocal microscopy and its use in clinical practice. JAAD Case Reports 2018; 4 (10):1014–23. Journal.

Дополнительные материалы на DermNet