Что такое хромосомы?

Хромосомы являются носителями генетического материала организма (дезоксирибонуклеиновой кислоты [ДНК]). В соматических клетках человека содержится 23 пары хромосом. В них заключена вся генетическая информация, необходимая для правильного функционирования каждой клетки организма.

Хромосомные аномалии могут приводить к развитию широкого спектра генетических нарушений, сопровождающихся задержкой развития, врожденными пороками и функциональной патологией различных органов и систем [1].

Эти генетические заболевания могут возникать в результате утраты или появления дополнительных хромосом, а также вследствие делеций или дупликаций отдельных их участков. В таких случаях клетка лишается специфических генов (или получает их избыток), что нарушает синтез белков и нормальное клеточное функционирование. Клинические примеры, имеющие значение в дерматологии:

Что такое цитогенетическое исследование?

Цитогенетика — это раздел генетики, изучающий структуру, функции и патологию хромосом [2].

Цитогенетическое исследование представляет собой анализ клеток образца крови, тканей, амниотической жидкости, костного мозга или спинномозговой жидкости, направленный на выявление изменений в хромосомном наборе индивидуума.

Выделяют три основных метода цитогенетической диагностики:

  • Стандартное кариотипирование;
  • Флуоресцентная гибридизация in situ (FISH);
  • Сравнительная геномная гибридизация (CGH) и матричная сравнительная геномная гибридизация (aCGH, хромосомный микроматричный анализ).

Кариотипирование

Кариотипирование было одним из первых методов анализа хромосом. Метод основан на световой микроскопии и стандартизированных протоколах дифференциального окрашивания клеток, находящихся в стадии метафазы клеточного цикла — в этот момент хромосомы выстраиваются по экватору веретена деления перед расхождением и максимально компактизованы (конденсированы) [3].

Для повышения информативности и точности хромосомного анализа применяют специфические красители, связывающиеся с ДНК и формирующие характерный полосатый рисунок (бэндинг), позволяющий идентифицировать конкретные хромосомы [3]. Наиболее часто используется дифференциальное G-окрашивание по Гимзе [3]. С помощью этой процедуры хромосомы систематизируют в виде кариограммы из 23 пар, что позволяет выявить анеуплоидию (изменение числа хромосом) и крупные транслокации (обмен участками между хромосомами).

Разрешающая способность рутинного кариотипирования ограничена: метод выявляет перестройки размером не менее 3 мегабаз (Мб) [3]. Любые аномалии меньшего размера не могут быть зафиксированы стандартным методом. Кариотипирование активно применяется для верификации таких патологий, как синдром Дауна и синдром Шерешевского — Тёрнера.

Хромосомы человека XXY

Трисомия 21 при синдроме Дауна

Флуоресцентная гибридизация in situ (FISH)

Метод FISH был внедрен в конце 1980-х годов и быстро завоевал признание как высокоэффективный цитогенетический тест в диагностике врожденных и приобретенных заболеваний [4]. FISH обладает значительно более высоким разрешением по сравнению со стандартным кариотипированием [3], особенно при исследовании интерфазных ядер (клеток вне митоза) [5].

В методе FISH используются флуоресцентно меченные зонды с комплементарными последовательностями оснований для подтверждения наличия или отсутствия конкретных участков ДНК в хромосомах [2,6]. Зонд и ДНК-мишень подвергаются температурной или химической денатурации для разрыва водородных связей, что обеспечивает последующую гибридизацию при смешивании образцов [5]. Флуоресцентные зонды образуют новые водородные связи с комплементарными локусами ДНК, которые затем визуализируются с помощью флуоресцентной микроскопии [5].

FISH широко применяется для обнаружения микроделеций и транслокаций, ассоциированных с педиатрическими синдромами и злокачественными новообразованиями [2]. Примерами служат выявление делеции 22-й хромосомы при синдроме Ди Джорджи и транслокации участков генов между 9-й и 22-й хромосомами при хроническом миелоидном лейкозе [2].

В онкодерматологии FISH-анализ используется при исследовании меланоцитарных новообразований с целью надежной дифференциации атипичных меланоцитарных невусов (например, невуса Шпиц) и меланомы кожи.

Патоморфологическое исследование меланомы у детей методом FISH

Сравнительная геномная гибридизация (CGH)

CGH — метод молекулярно-цитогенетического анализа, позволяющий выявлять вариации числа копий генов (CNV — участки генома, где фрагменты генов дублированы или утрачены) без необходимости культивирования живых клеток [7]. Изначально методология была разработана для картирования несбалансированных геномных изменений в опухолевой ткани [7,8].

В анализе CGH сопоставляются 2 генома: исследуемый образец и нормальный контроль; оба они метятся разными флуорофорами для четкой дифференциации [8]. Образцы денатурируют, смешивают и когибридизуют с нормальными метафазными хромосомами. Интенсивность флуоресцентного сигнала исследуемой ДНК относительно контрольной анализируется вдоль каждой хромосомы, отражая потери или амплификации генетического материала и позволяя зафиксировать вариации числа копий [8].

Принципиальное отличие CGH от других цитогенетических методов состоит в отсутствии необходимости заранее знать предполагаемую область мутации или иметь специфический целевой зонд [8]. CGH дает возможность провести общегеномное сканирование на наличие хромосомных дисбалансов, что неоценимо в сложных диагностических ситуациях [8]. Основным ограничением классической CGH является относительно невысокое разрешение: метод надежно выявляет изменения размером от 5–10 Мб [8].

Протокол матричной сравнительной геномной гибридизации

Матричная сравнительная геномная гибридизация (хромосомный микроматричный анализ, aCGH)

aCGH базируется на аналогичных принципах, однако обеспечивает значительно более высокую разрешающую способность за счет использования ДНК-микроматриц (микрочипов) [8]. В качестве мишеней для анализа служат короткие фиксированные фрагменты ДНК (олигонуклеотидные зонды), нанесенные на твердую подложку [8]. Как и в стандартной CGH, исследуемая и контрольная ДНК метятся разными флуоресцентными красителями.

После смешивания образцы наносятся на микроматрицу, где они конкурентно гибридизуются с фиксированными зондами [8]. По соотношению интенсивности флуоресцентных сигналов определяют микроделеции и микродупликации в геноме. Недостатком aCGH является ее неспособность детектировать сбалансированные хромосомные аберрации, такие как сбалансированные транслокации или инверсии [2].

Когда показано цитогенетическое исследование?

Цитогенетическое тестирование назначается при клиническом подозрении на наличие хромосомных или геномных мутаций.

Пренатальная диагностика при беременности высокого риска

Цитогенетический анализ выполняется во время беременности на материале, полученном инвазивным путем (биопсия ворсин хориона или амниоцентез), для исключения тяжелых хромосомных нарушений у плода, таких как трисомия 21 при синдроме Дауна.

Диагностическое обследование

Цитогенетические тесты часто применяются в педиатрии для установления этиологии задержки психомоторного развития, расстройств аутистического спектра или множественных врожденных пороков развития. Установление точной причины имеет критическое значение для родителей ребенка, позволяя выбрать правильную тактику ведения и определить дальнейший прогноз.

Гемобластозы и онкогематология

Методы цитогенетики незаменимы в гематоонкологии (например, при хроническом миелоидном лейкозе, где специфическая реципрокная транслокация между хромосомами 9 и 22 формирует филадельфийскую хромосому [Ph-хромосому], определяемую в 95% случаев).

Каковы противопоказания к цитогенетическому исследованию?

Абсолютных медицинских противопоказаний к проведению лабораторного цитогенетического анализа нет. Перед назначением инвазивного забора биоматериала и самого теста обязательно получение информированного добровольного согласия пациента (или его законных представителей).

В чем преимущества цитогенетического тестирования?

Цитогенетические методы позволяют верифицировать сложный клинический диагноз и оптимизировать долгосрочную тактику ведения пациента. Они также дают возможность провести квалифицированное медико-генетическое консультирование относительно рисков повторения патологии при последующих беременностях и определить показания для скрининга других членов семьи.

Каковы ограничения цитогенетического анализа?

Основным ограничением цитогенетических методов остается предел их аналитического разрешения. Различные технологии способны визуализировать несбалансированные перестройки, микродупликации, микроделеции и крупные транслокации, однако они не позволяют детектировать точечные мутации (однонуклеотидные варианты), которые также могут являться причиной патологии. Кроме того, существует вероятность обнаружения хромосомных аномалий с неясным клиническим значением (VUS), не связанным напрямую с текущим фенотипом пациента.

Литература

  1. US National Institutes of Health. Can changes in the structure of chromosomes affect health and development? Genetics Home Reference. December 2017. Доступно по ссылке: www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK115548/ (дата обращения: декабрь 2017)
  2. Appendix I: Genetic testing methodologies. In: Genetic Alliance; New York-Mid-Atlantic Consortium for Genetic and Newborn Screening Services. Understanding genetics: A New York, Mid-Atlantic guide for patients and health professionals. Washington DC: Genetic Alliance, 2009. Доступно по ссылке: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK115548/ (дата обращения: декабрь 2017)
  3. O'Conner C. Karyotyping for chromosomal abnormalities. Scitable by Nature Education. 2008. Доступно по ссылке: https://www.nature.com/scitable/topicpage/karyotyping-for-chromosomal-abnormalities-298 (дата обращения: декабрь 2017)
  4. Bishop R. Applications of fluorescent in situ hybridisation (FISH) in detecting genetic aberrations of medical significance. Bioscience Horizons 2010; 3: 85–95. DOI: 10.1093/biohorizons/hzq009. Journal
  5. Scitable by Nature Education. Clare O’Connor. Fluorescent in situ hybridisation (FISH). Nature Education 2008. Доступно по ссылке: https://www.nature.com/scitable/topicpage/Fluorescence-In-Situ-Hybridisation-FISH-327 (дата обращения: декабрь 2017)
  6. Chial H. Cytogenetic methods and disease: flow cytometry, CGH and FISH. Scitable by Nature Education. 2008. Доступно по ссылке: www.nature.com/scitable/topicpage/cytogenetic-methods-and-disease-flow-cytometry-cgh-772 (дата обращения: декабрь 2017)
  7. Weiss M, Hermsen M, Meijer G, et al. Comparative genomic hybridisation. Mol Pathol 1999; 52: 243–51. DOI: 10.1136/mp.52.5.243. Доступно по ссылке: PubMed Central (дата обращения: декабрь 2017)
  8. Theisen A. Microarray-based comparative genomic hybridisation (aCGH). Scitable by Nature Education. 2008. Доступно по ссылке: https://www.nature.com/scitable/topicpage/microarray-based-comparative-genomic-hybridisation-acgh-45432 (дата обращения: декабрь 2017)

Материалы по теме на DermNet

Книги по дерматологии